منبع پایان نامه ارشد درباره GSTT1، میکس، CAT

و دستگاه ها

دستگاههای مورد استفاده در این پژوهش عبارتند از:
1. سمپلر
2. ترازو
3. Vortex
4. میکروسانتریفیوژ
5. Electrophoresis( که شامل تانک و منبع جریان برق می باشد)
6. دستگاه PCR17
7. مایکروفر
8. اتوکلاو
9. دستگاه Gel documentation
10. Rotator
11. pH-meter
12. Hot plate

3-3: استخراج DNA

روش استخراج، روش Boiling یا جوشاندن است که DNA را از گلبولهای سفید خون محیطی جدا میکند. ابتدا باید محلولهای استخراج را آماده و سپس اتوکلاو کرد و بعد از اتوکلاو در آون قرار داده میشوند، در طی چند ساعت و سپس از آنها استفاده کرد.

3-4: مواد مورد استفاده برای انجام PCR

1) پرایمرهای Forward و Reverse ژنهای GSTM1، GSTT1 و –globineβ (ساخت شرکت تکاپوزیسیت)
2) پرایمرهای Forward و Reverse ژن CAT
3) آب استریل
4) 10x buffer
5) MgCl2
6) dNTPs
7) Taq Polymerase

3-5: واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR)

برای انجام این نوع PCR باید کلیهی مواد مورد استفاده را از فریزر 20- به جز آنزیم Taq Polymerase بیرون آورد و همه را ذوب کرد و تمام مواد مورد استفاده به جز dNTPs را باید ورتکس و مواد مورد استفاده برای ساختن میکس PCR را بر روی ظرف یخ قرار میدهیم. buffer 10xو MgCl2 قبل از استفاده باید با درجه ی 7 یا 8 ورتکس شوند و پرایمرها را در حد خیلی کم باید ورتکس شوند. پس از ساختن میکس PCR آنزیم Taq Polymerase را به آن اضافه کرد. آنزیم Taq Polymerase در ته تیوب حاوی میکس ته نشین می شود از پیپت کردن جهت همگن کردن محلول میکس استفاده می شود. برای تهیه ی 25میکرولیتر محلول واکنش PCR به ازای هر تیوب مطابق جدول زیر باید عمل کرد.

جدول3-1- مواد مورداستفاده برای تهیه واکنش میکس multiplex-PCR
مواد مورد استفاده
مقدار مورد استفاده (μl)
آب استریل
95/9
10x buffer
5/2
MgCl2
75/0
dNTPs
5/0
پرایمر رفتGSTM1
1
پرایمر برگشتGSTM1
1
پرایمر رفتGSTT1
1
پرایمر برگشتGSTT1
1
پرایمر رفتβ-globine
1
پرایمر برگشتβ-globine
1
Taq polymerase
3/0
DNA template
5

جدول3-2- مواد مورداستفاده برای تهیه واکنش میکس ژن CAT
مواد مورد استفاده
مقدار مورد استفاده (μl)
آب استریل
95/13
10x buffer
5/2
MgCl2
75/0
dNTPs
5/0
پرایمر رفتCAT
1
پرایمر برگشتCAT
1
Taq polymerase
3/0
DNA template
5

3-6- تعیین ژنوتیپ

3-6-1- تعیین ژنوتیپ ژن های GSTM1، GSTT1
پرایمر های مورد استفاده برای واکنش multiplex PCR برای ژنهای GSTM1و GSTT1
(GSTM1) Forward: 5′-GAA CTC CCT GAA AAG CTA AAG C-3′
(GSTM1) Reverse: 5′-CTT GGG CTC AAA TAT ACG GTG G-3′
(GSTT1) Forward: 5′-TTC CTT ACT GGT CCT CAC ATC TC-3′
(GSTT1) Reverse: 5′-TCA CCG GAT CAT GGC CAG CA-3′
(β-globine) Forward: 5′-CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC-3′
(β-globine) Reverse: 5′-GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC-3′

بتا گلوبین جز ژن های خانه دار18 هست که از آن به عنوان کنترل داخلی استفاده می کنند. در مرحله آخر میکس حاوی نمونهها در درون دستگاه PCR قرار میدهیم. برنامه multiplex-PCR برای این ژنها مطابق جدول زیر تنطیم گردیده است. تعداد سیکلهای تنظیم شده برای تکثیر این ژنها 30 سیکل می باشد.
جدول 3-3- برنامه mulitiplex-PCR برای تکثیر ژنهای GSTM1، GSTT1
مرحله
دما بر حسب سانتی گراد
زمان
دناتوراسیون اولیه
94
5دقیقه
دناتورسیون
94
1دقیقه
اتصال
5/65
40 ثانیه
طویل شدن
72
1دقیقه
بسط نهایی
72
5دقیقه

محصول multiplex-PCR دارای یک تا سه باند است. کنترل داخلی در همه ی نمونهها دیده میشود و طول باند آن 268 جفت باز میباشد. دو باند دیگر که طول آنها 219 و 459 جفت بازی میباشد به ترتیب مربوط به ژنهای GSTM1و GSTT1 هست. ژنوتیپ ژنهای GSTM1و GSTT1 به صورت null و present در افراد مشاهد میشود در حضور کنترل داخلی بتاگلوبین پلیمورفیسم این ژنها قابل تشخیص است.

3-6-2: تعیین ژنوتیپ ژن19CAT
پرایمرهای مورد استفاده برای تکثیر ژن CAT :

(CAT) Forward: 5′-CTGATAACCGGGAGCCCCGCCCTGGGTTCGGATAT-3′
(CAT) Reverse: 5′-CTAGGCAGGCCAAGATTGGAAGCCCAATGG-3′

برنامهی PCR برای تکثیر ژن کاتالاز مطابق جدول زیر تنظیم گردیده است. تعداد سیکل های تنظیم شده برای تکثیر این ژن 35 سیکل میباشد.

جدول 3-4- برنامهی PCR برای تکثیر ژن CAT
مرحله
دما بر حسب سانتی گراد
زمان (دقیقه)
دناتوراسیون اولیه
94
5
دناتوراسیون
94
1
اتصال
68
1
طویل شدن
72
1
بسط نهایی
72
10

محصول PCR برای ژن کاتالاز یک قطعهی 190 جفت بازی میباشد. که پس از انجام PCR نیاز به آنزیم محدودکننده برای برش ژن کاتالاز داریم. مواد مورد استفاده برای برش ژن کاتالاز پس از PCR
➢ آب استریل
➢ آنزیم محدودکنندهی EcoRV
➢ بافر H
مقدار مورد استفاده برای انجام RFLP برای ژن CAT در هر نمونه بصورت زیر میباشد:
1. آب استریل: 5/17 میکرولیتر
2. آنزیم محدودکننده EcoRV: 5/0 میکرولیتر
3. بافر H: 2 میکرولیتر
4. محصول PCR : 10 میکرولیتر
پس از تهیهی مخلوط فوق آن را spin downکرده، و آن را به مدت30/16 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد در انکوباتور قرار میدهیم.

3-7: الکتروفورز

3-7-1: مواد مورد استفاده جهت انجام الکتروفورز
1) آگاروز
2) TBE 5X
3) TBE 0/5X
4) 6x loading buffer
5) DNA ladder
6) اتیدیوم بروماید

3-7-2: طریقهی تهیهی محلولهای مورد استفاده جهت انجام الکتروفورز
– TBE 5X
54 گرم Tris base و 5/27 گرم Boric Acid را وزن کرده و در داخل شیشهی یک لیتری میریزیم و 20 میلی لیتر EDTAرا بر روی آن ریخته سپس مقدار کمی آب به آن اضافه میکنیم و خوب هم میزنیم و پس از هم زدن حجم آن را به 1000 میرسانیم.
– TBE 0/5X
100 میلی لیتر از TBE 5X را با 900 میلی لیتر آب تصفیه شده مخلوط کرده و پس از هم زدن خوب TBE 0/5X برای استفاده آماده است.
– محلول اتیدیوم بروماید برای رنگ آمیزی ژل
70 میکرولیتر از رنگ اتیدیوم را در 700 میلی لیتر TBE 0/5X حل میکنیم
– محلول EDTA
38/5 گرم EDTA را در 30 میلی لیتر آب تصفیه شده حل کرده و PH آن به 8 میرسانیم

3-7-3: الکتروفورز GSTM1 و GSTT1 و رنگ آمیزی ژل
پس از انجام PCR قطعات DNA حاصل را در چاهکهای ژل اگارز %5/1 load کرده (جهت درست کردن ژل آگاروز از مایکروفر استفاده می شود) و پس از اتصال جریان برق DNA چون دارای بار منفی هست به طرف قطب مثبت حرکت کرده، وقتی بر روی ژل مسافتی بیش از نصف طول ژل را طی کرد آن را در درون رنگ اتیدیوم بروماید در حدود 10 دقیقه قرار میدهیم و پس از رنگآمیزی در دستگاه Gel Documentation آن را مشاهده خواهیم کرد. اگر شخص مورد نظر برای هر دو تا ژن GSTM1 و GSTT1 نول باشد، فقط یک باند که مربوط به ژن بتا-گلوبین است دیده خواهد شد، که طول این باند 268 جفت باز میباشد. اگر شخص مورد نظر برای ژن GSTT1 نول باشد، باند مربوط به ژن بتا-گلوبین و ژن GSTM1دیده خواهند شد، که طول این باندها به ترتیب 268 و 219 جفت باز میباشند. اگر فردی هر دو تا ژن GSTM1 و GSTT1 را داشته باشد سه باند ژنی که مربوط به ژن های GSTT1، بتا-گلوبین و GSTM1 است دیده خواهند شد. که طول آنها به ترتیب 459، 268 و 219 جفت باز می باشند. در شکل 1-3 ژنوتیپ مربوط چندشکلی ژن های GSTM1 و GSTT1 نشان داده شده است.

شکل 3-1- یک نمونه از آنالیز multiplex-PCR مربوط به چندشکلی ژن های GSTM1 و GSTT1
خط1: مارکر 100 جفت بازی، خط2: present/GSTT1-present GSTM1-، خط3: null/GSTT1-present GSTM1-، خط4: null/GSTT1-null GSTM1-، خط5: present/GSTT1-null GSTM1-

در این سایت فقط تکه کوچیکی از متن پایان نامه درج می شود برای دانلود متن کامل روی عکس زیر کلیک کنید
Previous Entries منبع پایان نامه ارشد درباره مواد مخدر، مصرف مواد، سوء مصرف مواد Next Entries منابع پایان نامه ارشد با موضوع تلفن همراه، حمل و نقل

دیدگاهتان را بنویسید

*