پایان نامه درمورد نور فلورسنت

ورتکس
مواد مورد نياز براي ساخت Master Mix در PCR
3-6-2- روش کار
ابتدا قبل از شروع ساخت اجزاء Master Mix نمونه DNA هايي که در20- ذخيره شدند را در دماي اتاق گذاشتيم تا ذوب شوند. سپس به تعداد نمونه هاي DNA طبق جدول 3-2 Master Mix ساخته شد(14،11).

جدول-2-3- مقادير لازم براي واکنش 25ميکروليتري PCR ناحيه ITS
12.5?L
Ready PCR
Master Mix
0.5 ?L
Primer ITS 1
0.5 ?L
Primer ITS 4
2 ?L
templete DNA
9.5 ?L
D.W
25 ?L

بعد از ساخت Master Mix به هر ميکروتيوب 2 ميکروليتر DNA الگو اضافه شد و حجم کل محلول به ?l 25 رسيد. سپس به دستگاه ترموسايکلر انتقال داده شد و بعد از انجام 35 سيکل دمايي تکثير اختصاصي قطعات ژنيITS rDNA مورد نظر صورت گرفت(جدول 3-3).

جدول-3-3- برنامه مراحل مختلف PCR
زمان
دما
تعداد چرخه
مراحل
نام مراحل
2 دقيقه
C°95
1 سيکل
1
Pre Heat
45 ثانيه
°C94
35 سيکل
2
Denaturation
1:30 ثانيه
°C52

3
Annealing
30 ثانيه
°C72

4
Extension
7 دقيقه
°C72
1 سيکل
5
Final Extension

3-6-3- نکاتي که بايد در هنگام انجام PCR بايد رعايت کرد
1- قبل از انجام کار بايد تمامي سطوح با محلول هيپوکلريت 10%(وايتکس) و الکل 70% آلودگي زدايي شوند. اين کار منجر به دپورينه شدن و هيدروليز سريع مولکول هاي اسيد نوکلئيک آلوده کننده مي شود.
2- جداسازي قسمت آماده سازي PCR با دستگاه ترموسيکلر و بخصوص الکتروفورز زيرا محصولات تکثيري حاصل از PCR از مهمترين منابع آلودگي به شمار مي آيند.
3- استفاده از دستکش هاي پلاستيکي يا لاتکس يکبار مصرف و پوشيدن روپوش آزمايشگاهي تا آلودگي از طريق پوست و لباس به حداقل برسد.
4- جداسازي سمپلرها، سرسمپلرها، روپوش، تيوب هاي واکنش از قسمت آماده سازي PCR با قسمت الکتروفورز.
5- تمامي محلولهاي استوک و پرايمرها بايد در تيوب هاي کوچکتر تقسيم شوند تا اگر يکي از محلول ها آلوده شد کل استوک آلوده نشود و بتوان به راحتي محلول آلوده را از بين برد.
6- در مواردي که آلودگي شديد است بهتر از پرايمري ديگر براي PCR استفاده شود تا از وجود ويا عدم وجود DNA الگو اطمينان حاصل کرد. اگر آلودگي با محصولات تکثيري بود بايد محلول هاي کار دور انداخته شود و تمام سطوح با اسيد هيدروکلريک 1نرمال و يا پسورالن آلودگي زدايي شوند(50،47،11).
3-6-4- استفاده از کنترل مثبت ومنفي در کيفيت PCR
دارا بودن کنترل مثبت و کنترل منفي در PCR به ترتيب به تشخيص حضور يا عدم حضور نتايج PCR منفي کاذب و مثبت کاذب کمک مي کند.
1. کنترل مثبت
استفاده از کنترل مثبت تا حد ممکن کمک به جلوگيري از نتايج منفي کاذب مي کند. اگر يک کنترل مثبت در PCR يا نمونه باليني که مشخص شده که داراي مقدار کافي از مولکول هاي هدف اختصاصي براي مشاهده بعد از الکترفورز مي باشد، محصول تکثيرشده توليد نکند، آنگاه نتايج آزمايش به عنوان يک نتيجه PCR منفي در نظر گرفته مي شود. عواملي که موجب منفي کاذب مي شود شامل: مقدار ناکافي از DNA الگو، عدم حضور يا کيفيت پايين يکي از ترکيبات مخلوط PCR، اشکال در طراحي پرايمر، برنامه نادرست چرخه دمايي در دستگاه PCR (دماي اتصال خيلي بالا و يا تعداد چرخه هاي ناکافي) (50،47،14،11).
2. کنترل منفي
کنترل منفي به صحت اينکه هر محصول تکثير شده PCR فاقد آلودگي است کمک مي کند. اگر کنترل منفي در PCR محصول تکثيري توليد کند، آنگاه نتايج آزمايش مثبت کاذب در نظر گرفته مي شود و حاکي از آلودگي مخلوط PCR است. اين آلودگي ممکن است از طريق فضاي آزمايشگاه يا از محصولات تکثير شده قبلي باشد (50،47،14،11).
3-6-5- الکتروفورز نمونه هاي PCR شده بر روي ژل آگارز
* ژل آگارز
آگار مخلوطي از دو پلي ساکاريد آگارز و آميلوپکتين است که از چند گونه جلبک دريايي به دست مي آيد. در دماي اتاق جامد است و بصورت تجاري در اشکال پودري يا دانه اي موجود مي باشد. عمده ترين تفاوت انواع آگارز در ميزان خلوص آن از نظر عدم وجود پلي ساکاريد باردار(خاصيت الکترواسمز)، درجه ذوب، قوام و ميزان شفافيت است. داشتن خاصيت کمتر الکترواسمز وشفافيت بيشتر از عمده ترين شرايط بهينه آگارز براي استفاده از آن در روش هاي الکتروفورز مي باشد(50،47،14،11).
آگارز که معمولاً به صورت پودر است را مي توان با افزودن مقدار معيني از آن به بافر يا آب مقطر و حرارت دادن به صورت محلول در آورد. با کاهش دماي آن به حدود 50-40 درجه سانتيگراد (بسته به نوع آگارز) به حالت ژل درآمده و ساختمان اسفنجي پيدا مي کند. اندازه منافذ آگارز وابسته به غلظت آن است. زنجيرهاي آگارز رشته هاي مارپيچي را تشکيل مي دهند که ساختار ابرمارپيچي با طول 30-20 نانومتر دارند. سرعت حرکت DNA در ژل آگارز به فاکتورهايي مانند اندازه مولکول DNA، غلظت آگارز، ساختار سه بعدي DNA، نوع آگارز، بافر الکترفورز و وجود اتيديوم برومايد در ژل و ولتاژ و آمپر اعمالي به ژل و همچنين مدت زمان الکتروفورز بستگي دارد. مولکول هاي بزرگتر در ميان حفره هاي ژل به دام مي افتند و نسبت به مولکول هاي کوچکتر کندتر حرکت مي کنند. هر چه غلظت ژل بيشتر باشد حرکت DNA در ژل کندتر است. حضور اتيديوم برومايد در ژل و بافر باعث کاهش بار منفي DNA در رشته و افزايش حجم آن مي شود ودر نتيجه حركت کندتر مي شود(50،47،14،11).
مرسوم ترين روش براي مشاهده DNA در ژل هاي آگارز، رنگ آميزي با اتيديوم برمايد است. اتيديوم برمايد با داشتن يک گروه حلقوي مسطح در ميان DNA قرار مي گيرد و در اثر تابش UV نور فلورسنت توليد مي کند. در اين مطالعه برحسب اندازه DNA مورد نظر براي الکتروفورز از ژل 2% استفاده شد(50،47،14،11).
3-6-6- مواد و وسايل مورد نياز براي الکترفورز ژل آگارز
* پودر آگارز (Sigma,USA)
* بافر TBE با غلظت 1X

نکته مهم : در این سایت فقط تکه هایی از این پایان نامه به صورت رندم درج شده که ممکن است موقع انتقال از فایل ورد به داخل سایت عکس ها درج نشوند یا فرمول ها و نمودارها و جداول و ... به هم ریخته درج شوند ولی در سایت منبع شما می توانید فایل کامل را با فرمت ورد و منابع و پیوست ها دنلود نمایید

برای ورود روی عکس زیر می توانید کلیک کنید :

Previous Entries پایان نامه درمورد پرايمر، دماي، دقيقه Next Entries پایان نامه با واژگان کلیدی مصرف کننده